长寿相关的基因特征有哪些？

• 长寿相关的基因特征有哪些？
  
  

  为了延年益寿，人类从未停止过探索。在近几十年的研究过程中，科学家们发现了药物干预、基因干预和饮食干预等多种延长寿命的方式，例如服用阿卡波糖、生长激素受体突变和饮食限制等。然而，对于促长寿干预措施的认知，实践远远走在理论之前，对于这些干预方法究竟为何可以延年益寿，我们仍然知之甚少。

  2019年9月3日，《Cell Metabolism》杂志刊登了题为“Identification and Application of Gene Expression Signatures Associated with Lifespan Extension”的文章。来自美国哈佛医学院的Vadim N. Gladyshev团队以小鼠为对象，开创性地综合了目前已知的多种促长寿干预措施，对不同促干预下的小鼠的基因表达情况进行了综合分析，揭示了与长寿密切相关的基因表达模式。此外，作者根据长寿的基因表达特征提出了一种算法，用以预测新的延长寿命的干预方式，为寻找新的干预措施提供了全新的思路。

  

  通讯作者Vadim Gladyshev，美国哈佛医学院（图片源自网络）

  促长寿干预下的肝脏组织转录组分析

  研究人员选取了8种已知的促长寿干预措施，包括阿卡波糖（acarbose），17-a-雌二醇（17-a-estra-diol），雷帕霉素（rapamycin），普罗坦定（Protandim），卡路里限制（caloric restriction，CR，40%），蛋氨酸限制（methionine restriction，MR，0.12% methionine w/w），生长激素受体基因敲除（growth hormone receptor knockout，GHRKO），和Pit1敲除（Snell侏儒症小鼠）（图1A），以UM-HET3小鼠作为实验对象（MR干预在C57BL/6J小鼠上进行），每种干预雌雄各设置三个生物学重复，共78只小鼠，分别采取这8种促长寿干预措施，而后对实验小鼠的肝脏样本进行RNA-seq检测，以同窝出生、相同年龄和性别、未做处理的小鼠作为对照，对实验组和对照组不同性别分别分析。

  研究人员对不同干预措施中重叠部分的差异表达基因进行功能富集分析（图1B）。结果显示除了MR之外，其它干预措施下的小鼠肝脏都发生了核糖体蛋白基因表达的上调。其他普遍上调的基因功能包括细胞色素p450参与的药物代谢、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化和三羧酸（TCA）循环。有趣的是，已知在雄性个体中，几种干预措施的寿命延长效果与脂肪酸氧化能力正相关（Amador Noguez et al.，2004），但本研究结果显示在雌性个体中，脂肪酸氧化强度在17-a-雌二醇、阿卡波糖和CR干预中却显著下调（图1C）。

  

  图1. A. RNA测序数据集（X表示采取的实验组，灰色的X表示没有显著延长寿命）

  B. 不同促长寿干预影响基因表达变化的重叠分析 C. 促长寿干预差异表达基因的功能富集分析

  促长寿干预引起雌性化效应

  促长寿干预措施对雌性和雄性基因表达模式影响的差异激起了研究人员们的兴趣。已有研究发现，在CR和GHRKO干预下，雄性个体的基因表达会出现“雌性化”效应，即雌性特异性基因表达的上调和雄性特异性基因表达的下调（Buckley and Klassen，2009；Estep et al.，2009；Fuand Klassen，2014）。

  以“雌性化”为线索，研究人员在雄性个体中检测到基因和饮食干预下，实验组小鼠的基因表达水平出现显著的雌性化模式（图2A）。然而其它药物干预，如6月龄小鼠的普罗坦定干预（图2A），对雄性小鼠并没有显著的雌性化作用，甚至产生了轻微的负面效果。雷帕霉素处理的雌性小鼠也出现了显著的反雌性化（“雄性化”）模式。

  因此，虽然许多延长寿命的干预措施影响了一些与性别特异性差异相关的基因，但是雌性化（或雄性化）似乎既不是长寿的必然结果，也不是长寿的充分条件。

  尽管如此，研究人员发现促长寿干预似乎会使两种性别相关基因的表达谱汇聚为某种中性状态。他们计算了所有实验组的雄性和雌性样本之间性别特异性基因表达的差异距离（图2B），结果发现，除了6月龄的普罗坦定干预组和12月龄的雷帕霉素干预组外，其他所有干预措施确实显著降低了性别相关差异。这一发现表明，促长寿干预措施在不同性别之间引起了趋同的基因表达状态变化，也使得雄性和雌性之间的差异变得不那么显著。

  

  图2. A. 不同干预措施下基因表达变化的雌性化效应

  （正值表示雌性化，数值越大雌性化越显著；负值表示反雌性化，即雄性化，数值越小越显著）

  B. 促长寿干预减少性别基因表达差异

  卡路里限制，雷帕霉素和生长激素缺乏干预的特征

  为了全面了解促长寿干预措施引起的基因表达变化，研究人员收集了小鼠肝脏的已发表的微阵列（microarray）数据，并进行了荟萃分析（meta-analysis）。

  通过基因富集分析（GSEA），研究人员进一步确定了至少在两种干预措施下（CR、GHRKO和雷帕霉素）同时响应的分子通路（图3A）。氧化磷酸化相关基因在三种干预措施中均有上调。其他共同的上调基因功能包括TCA循环、核糖体和衰老相关疾病（帕金森病和亨廷顿症）等。

  为了确定上述基因表达变化的上游调控因子，研究人员使用TRANSFAC对转录因子进行了富集分析（Matys et al.，2006）。结果发现CR和GHRKO有50%以上的富集转录因子存在重叠，雷帕霉素干预也与其他干预措施有显著重叠。有趣的是，有8种转录因子在这三种干预措施中均有富集，包括与葡萄糖敏感性和固醇代谢相关的受体，如糖皮质激素受体NR3C1和固醇调节元件结合转录因子SREBP-1（图3B）。

  

  图3. A. 基因特征的功能富集分析

  B. 基因特征富集的转录因子的重叠分析

  促长寿干预措施的结合分析

  在综合公共微阵列数据与现有数据后，研究人员得到了涵盖饮食、基因（突变和过表达）和药物干预的综合数据集。他们计算了不同干预措施引起的全基因表达模式，发现在整体基因表达变化上，大多数干预措施之间的基因表达变化趋于一致（图4C）。进一步使用特定干预措施的基因特征作为输入子集进行GSEA富集分析（图4A）。有趣的是，大多数干预措施都与CR和GHRKO引起的变化相同，但雷帕霉素处理却出现了明显不同的基因表达模式。最初人们认为雷帕霉素延长寿命的作用机制与饮食限制类似，但实验结果显示雷帕霉素干预的基因表达谱与饮食限制并没有显著的相似性，甚至有轻微的相反趋势。研究人员利用Cytoscape工具，将每对显著正相关的干预措施进行了关联（图4B），与之前发现的一致，大多数干预措施显示出与CR和GHRKO高度的相似性。

  

  图4. A. 基于CR、雷帕霉素和GHRKO基因特征的促长寿干预措施GSEA富集分析（每个单元格表示基于GSEA计算的显著性得分）

  B. 基于基因表达谱相似性的干预网络

  C. CR、雷帕霉素和GHRKO的基因表达特征与其他促长寿干预措施基因特征的相关性

  促长寿干预共同的基因特征

  作者使用单一的混合效应模型来寻找共有的特征。最终，确定了166个上调基因和134个下调基因（图5）。

  

  图5. 干预后基因表达谱的变化（166个上调，134个下调）

  最常见的上调基因是Cth，其可作为与长寿相关的简单分子标志物。另一个普遍上调的基因是Brca1，是促长寿干预的共同特性之一。

  为了确定与共同的上调基因和下调基因特征相关的通路，作者进行了功能性GSEA，其结果与RNA-seq的结果一致，上调最显著的是与细胞色素p450的药物代谢和NRF2通路激活的谷胱甘肽代谢相关的基因。下调的是与原发性免疫缺陷、RNA聚合酶和tRNA代谢过程相关的基因。

  之后作者整合了另外两种组织的数据：骨骼肌和白色脂肪组织。使用相同的方法和阈值，作者分别在骨骼肌和白色脂肪组织中鉴定出160个和390个上调基因，以及123个和325个下调的基因。

  影响寿命的特征

  为了识别与寿命延长程度正相关和负相关的基因，作者将前面描述的混合效应回归模型与三个常用的寿命指标相结合：median lifespan ratio（中位寿命比）、maximum lifespan ratio（最大寿命比）和median hazard ratio（中位风险比）（比例指组内有50%个体存活时生存曲线的斜率）。作者共检测到351、258和183个分别与三种指标呈正相关的基因，以及264、191和108个呈负相关的基因（图6）。结果发现这些基因集具有明显的重叠，尤其是在中位寿命比和最大寿命比之间。其中Hint3与寿命正相关性最强，Irf2与寿命负相关性最强。此外，作者开发了一个基于R语言的应用程序GENtervention，将自己的研究数据与结果公开。

  

  图6. 与最大寿命正相关的基因（351个）和负相关的基因（264个）

  长寿特征在验证候选延长寿命干预中的应用

  作者总结了以往报道过的促长寿干预措施相关的基因表达特征，并提出一种假设，即基因表达特征可以作为一种预测因子来寻找新的促长寿干预途径。接下来，作者从两方面检验这种假设的可行性。

  首先，为了检验长寿特征是否可以用来发现干预措施与长寿基因表达之间的关联，作者对小鼠进行了6项干预，包括注射白细胞介素6（IL-6）、Mat1a基因敲除、慢性缺氧、Keap1基因敲除、补充SIRT1激活剂SRT2 104，以及SIRT6过表达。结果表明这些干预措施均与预期一致，相应地延长或缩短了小鼠的寿命。此外，作者鉴定了小鼠C57BL/6和DBA/2品系之间显著差异表达的基因，并对它们进行了关联试验，发现可以凭借这种差异能够识别寿命更长的品种。试验结果支持了长寿特征可用于评估预期寿命差异的假设。

  而后，为了检验长寿特征是否可以用来发现具有显著长寿效应的药物，作者使用Connectivity Map平台确定候选的延长寿命药物，并基于与最大寿命比相关基因的相关性，选择了排名前四的化合物处理UM-HET3雄性小鼠1个月。最终结果与预测一致，所有化合物都与延长寿命的干预措施中的基因特征呈正相关。

  总的来说，该研究表明了这种方法适用于寻找新的延长寿命的干预措施。

  总 结

  作者发现当对小鼠进行基因表达干预或饮食干预的时候，雄性基因表达发生明显雌性化，这一效应与常见基因和分子通路的干扰有关，包括生长激素调控的基因和分子通路。雌性化效应虽然不能完全解释雌性化与寿命延长之间的关系，但雌性化过程与性别相关差异的缩小有关。此外，作者通过对微阵列数据进行更深层次的分析，发现促长寿干预大多影响了类似的基因和信号通路，并利用GENtervention公开了自己的研究数据和结果。最后，作者根据以上结果提出并验证了一种假设——基因表达特征可作为一种预测因子来寻找新的促长寿干预途径。

  

  参考文献：

  1. Amador-Noguez, D., Yagi, K., Venable, S., and Darlington, G. (2004). Gene expression profile of long-lived Ames dwarf mice and Little mice. Aging Cell 3, 423–441.

  2. Buckley, D.B., and Klaassen, C.D. (2009). Mechanism of gender-divergent UDP-glucuronosyltransferase mRNA expression in mouse liver and kidney. Drug Metab. Dispos. 37, 834–840.

  3.. Estep, P.W., Warner, J.B., and Bulyk, M.L. (2009). Short-term calorie restriction in male mice feminizes gene expression and alters key regulators of conserved aging regulatory pathways. PLoS One 4, e5242.

  4. Fu, Z.D., and Klaassen, C.D. (2014). Short-term calorie restriction feminizes the mRNA profiles of drug metabolizing enzymes and transporters in livers of mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 274, 137–146.

  5. Matys, V., Kel-Margoulis, O.V., Fricke, E., Liebich, I., Land, S., Barre-Dirrie, A., Reuter, I., Chekmenev, D., Krull, M., Hornischer, K., et al. (2006). TRANSFAC(R) and its module TRANSCompel(R): transcriptional gene regulation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 34, D108–D110.