抗生素抗性基因在养殖废水中的分布

• 抗生素抗性基因在养殖废水中的分布
  
  
  畜禽养殖场作为抗生素抗性基因的一个热点区，其产生的废水中存在大量的抗生素抗性基因，直接排放将会污染接受的水体．本研究以微生物固化曝气技术为核心，构建了一个包含沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘的养殖废水处理系统．采用高通量荧光定量PCＲ 技术，探究各种抗性基因在进水、各处理池和出水中的种类、多样性和丰度的变化以及可能的影响因素．研究发现： （ 1） 微生物固化曝气技术能有效降低养殖废水中抗性基因的种类和多样性； （ 2） 该技术也能有效去除养殖废水中抗性基因的绝对丰度，去除率高达93．6%； （ 3） 养殖废水出水中抗性基因绝对丰度仍高于自然水体，其直接排放仍有抗性基因污染风险； （ 4）畜禽养殖废水中TN 和土霉素的含量与许多抗生素抗性基因总丰度存在正相关性．通过对TN 和土霉素的去除或者控制使用，可以有效降低养殖废水中的抗性基因。
   
  抗生素在预防、治疗微生物引起的疾病时具有良好的疗效，同时还能促进畜禽生长，所以被广泛用于畜禽养殖场［1-2］．然而大多数抗生素并不能被动物肠道完全吸收，大部分仍以母体或者相关代谢产物的形式排出体外［2-3］．这些排出体外的抗生素会对环境中的微生物产生一个选择压力，诱导和选择环境微生物产生耐药性，增加环境中抗性基因的丰度和多样性［4］．此外，喂食了抗生素的动物，其肠道内抗性基因的丰度和多样性均有所提高［5］．动物肠道内的耐药菌和抗性基因随着动物的排泄进入环境中，直接增加了环境中抗性基因的丰度及多样性。
   
  抗生素抗性基因是一种新型的环境污染物［3，6］．携带抗生素抗性基因的微生物（ 如致病菌等） 能对相应的抗生素产生耐药性，这使得抗生素在治疗由致病菌引起的疾病时疗效下降甚至无效，严重威胁人类健康［4，7］．2011 年德国爆发“毒黄瓜”事件，在欧洲至少9 个国家蔓延，造成33 人死亡，超过3000 人受到感染，其中至少470 人出现肾功能衰竭并发症，引起本次疫情的就是一种新型的高传染性携带多种抗性基因的致病菌［4］．在美国每年有超过200 万人感染耐药病原体，其中有14000 人死亡［6］。
   
  固化微生物污水净化器（ biocleaner） 是Bio Cleaner 公司研发的由微生物发生器与高效曝气装置组合的污水治理专用设备．对该装置处理养殖废水的研究结果表明： （ 1） 微生物固化曝气技术能有效去除常规污染物，除TP 外，COD 和NH+4 -N 的出水浓度均能达到《畜禽养殖业污染物排放标准》（ GB 18596—2001） ； （ 2） 该技术对抗生素的去除效果依抗生素的种类而变，对4 种四环素类抗生素的去除率高达85%以上； 对大环内酯类中的阿奇霉素的去除率为62．8%； 对大环内酯类中的罗红霉素和氟喹诺酮类抗生素则基本无效［8］。
   
  本研究在之前研究［8］的基础上，采用高通量荧光定量PCＲ 技术，进一步研究： （ 1） 养殖废水中各种抗生素抗性基因在进水、各处理池、出水中的分布与变化； （ 2） 固化曝气技术对各种抗生素抗性基因的去除效果； （ 3） 各种抗性基因的去除效果与常规污染物和抗生素的去除是否有耦合关系。
   
  1 材料与方法（ Materials and Methods）
   
  1．1 系统运行
   
  处理系统采用美国Biocleaner 技术，由沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘组成．各处理单元的尺寸（ 长×宽×高） 分别为： 沉淀池25 m×20 m×5 m、一级处理池25 m×20 m×2 m、二级处理池25 m×20 m×2 m 和氧化塘40 m×30 m×4 m［8］．各处理单元用管道连接，按照高程由高到低，依次排列沉淀池、一级处理池、二级处理池和氧化塘，省去不同处理单元间依靠泵为动力进行的水力流动．该处理系统废水来自于附近多个养殖场直排的清粪水，每日污水处理量为150—200 t．在一级处理和二级处理池中分别放置一个曝气机和一个Biocleaner 设备，曝气机功率为2．2 kV，采用人工开启电闸控制，运行时间为24 h·d－1 ．Biocleaner 设备装载微生物载体，无需人工维护．系统自2013 年8 月试运行，经过12 个月调试，于2014 年8 月稳定运行．本研究以稳定运行监测数据进行分析。
   
  1．2 样点布设与采样点概况
   
  研究样地位于龙岩市某养殖废水处理示范点．依据处理系统的运行情况，于2014 年8 月，进行1 次系统地采样，采集12 个点，其中进水1 个（ Ⅰ） ，沉淀池2 个（ Ⅱ） ，一级处理池（ Ⅲ） 、二级处理池（ Ⅳ） 和氧化塘（ Ⅴ） 各3 个（ 图1） ．分析测试了12 个点的NH+4 -N、NO－3 -N、TN、TP、COD、TOC、9 种抗生素（ 4 种四环素： 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素； 2 种大环内酯类抗生素： 罗红霉素、阿奇霉素； 3 种氟喹诺酮类抗生素： 氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星） ，研究结果已经发表［8］．本研究选取进水以及各处理单元出水样品（ Ⅰ-1、Ⅱ-2，Ⅲ-2、Ⅳ-3、Ⅴ-3） 进行抗生素抗性基因分析。
   
  1．3 DNA 提取
   
  根据水样的浑浊程度，量取一定体积的水样倒入50 mL 离心管中，12000 r·min－1转速离心10 min，倒掉上清液，在每个离心管中加入1 mL 生理盐水，将底部的沉淀充分混匀．再将样品全部转移至新的1．5 mL离心管中，18000 r·min－1离心5 min 后，倒掉上清液．若所得固体沉淀样品过少，则重复上述操作，直到所得样品约为0． 5 g．然后加入978 μL PBS 缓冲液（ FastDNA  SPIN kit for Soil 试剂盒，MPBiomedical，美国） ，并全部转移到试剂盒中的Lysing Matrix E 管，按试剂盒提供的操作说明进行提取．具体步骤如下： 加入122 μL MT Buffer，在FastPrep  仪器中进行振荡破碎均质化（ 时间30 s，速度6．0 m·s－1 ） ，然后对Lysing Matrix E 管进行离心处理（ 14000 r·min－1，15 min） ．将上清液转移到一个新的2 mL离心管中，加入250 μL PPS，并用手摇10 次进行混合．对样品再一次进行离心（ 14000 r·min－1，5 min） ，将上清液转移到一个新的2 mL 离心管中，并加入1 mL Binding Matrix Suspension，用手上下颠倒2 min，使DNA 附着到基质上，静置约3 min．去除约500 μL 上清，分多次将Binding Matrix 全部转移到SPINTM Filter 中，加入500 μL SEWS-M 到SPINTM Filter 中对Binding Matrix 进行清洗，通过离心去除SEWS-M，在室温下风干SPINTM Filter 5 min．最后加入70 μL DES 溶液进行DNA 洗脱。